羊肚菌研究进展
羊肚菌研究进展
陈向东 朱戎 兰进
（中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京, 100094）
摘 要 : 本文综述了近些年来羊肚菌成分、培养技术、细胞水平及生化与分子生物学等方面的研究进展。
关键词 : 羊肚菌 ；成分；培养技术； 细胞；生化与分子生物学
羊肚菌隶属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲（Discomycetes），盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)。羊肚菌以其菌盖表面生有许多小凹坑，外观极似羊肚而得名。它是一种野生名贵食药用菌，最早收录于李时珍《本草纲目》。中医以羊肚菌子实体入药。其性平，味甘寒，无毒，具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾、壮阳、补脑、提神之功能。研究发现羊肚菌有降血脂、调节免疫、抗疲劳、 抗放射、抗肿瘤作用 ，并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用。羊肚菌在国际市场上供不应求，且价格居高不下。因此人工栽培羊肚菌一直是食用菌界最感兴趣的课题之一。虽然人们已对羊肚菌的分类、分布、生态和栽培做了大量的研究，但羊肚菌子实体至今仍不能进行大规模的商品化生产。为了加快这一名贵食药用菌的开发，笔者就近年来国内外羊肚菌若干研究现状做一综述，以供广大研究者参考。
1. 羊肚菌的成分
粗柄羊肚菌子实体的营养成分分析测定结果为：粗脂肪的含量3.82%，由4种脂肪酸组成，其中亚油酸占56.0%，油酸28.41%，硬脂酸2.02%，软脂酸13.54%。不饱和脂肪酸含量占优势，是羊肚菌具有药用价值的重要原因之一。蛋白质含量22.06%，含19种氨基酸，其中含有8种人体必需氨基酸，并且含量丰富，占氨基酸总量的47.47%，高于一般食用菌25%-40%的水平。此外，羊肚菌中还含有几种稀有氨基酸，如 C-3-氨基-L-脯氨酸、α-氨基异丁酸、2,4-二氨基异丁酸，这是羊肚菌风味独特奇鲜的主要原因。对粗柄羊肚菌的菌盖、菌柄及液体培养菌丝中的可溶性蛋白质组分及氨基酸含量进行了测定和分析后发现菌丝的可溶性蛋白含量最高，菌盖次之，菌柄居第三位，而蛋白质种类则正好相反；菌丝中必需氨基酸含量最高，鲜味氨基酸以菌盖中最高，尤其是谷氨酸含量明显高出菌柄和菌丝，而甜味氨基酸则三者相差不大。
羊肚菌除含有丰富的多糖、蛋白质和脂肪酸外，还含有钙锌等多种矿物质和微量元素以及VB、VB等多种维生素。Bouillant从羊肚菌中分离到几种抗菌、抗病毒的活性成分，Tomita从子实体里提纯分离到血小板集落抑制因子（其效价比阿斯匹林高2~3倍）。
魏芸等从羊肚菌发酵液中分离到羊肚菌多糖MEP-SP1、MEP-SP2、MEP-SP3。MEP-SP1的分子量约为11500，是一种由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖残基为重复单位组成的杂多糖，其主链包括β-吡喃糖苷键；MEP-SP2的分子量为23000，由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖残基为重复单位组成，其主链包括α-吡喃糖苷键；MEP-SP3的分子量为44000，由木糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖和半乳糖残基为重复单位组成。王小雄从尖顶羊肚菌菌丝体中分离出一种新化合物，命名为羊肚菌三醇, 此化合物存在一个异戊烯基侧链，与C4相连且为β构型。
2. 培养技术的研究
子实体的获得受多种条件的限制，液体发酵可以进行工业化连续生产，具有规模大，产量高，发酵周期短，生产效益高的优点。1958年J.Sguecs首次在发酵罐内培养出羊肚菌菌丝球，导致了美、法等国的大规模羊肚菌菌丝工业化生产。多年来科研工作者致力于摸索有利于建立菌丝体生物量及最佳发酵工艺条件，不断改进风味、营养成分和有效成分，已取得了丰硕的成果。
张松以200rpm、25-27℃为培养条件，发现羊肚菌在麦麸酵母膏液体培养基（麦麸5%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.1%，葡萄糖2%, MgSO0.1%, KHPO0.1%），尖顶羊肚菌在麦麸黄豆粉液体培养基（麦麸4%，黄豆粉1%，葡萄糖2%，MgSO 0.1%, KHPO0.1%），高羊肚菌在黄豆芽玉米粉液体培养基（黄豆芽2%，玉米粉1%，黄豆粉1%，葡萄糖2%, MgSO0.1%, KHPO0.1%）上培养，可获得菌丝球多，大小较均匀，质量较高的液体菌种，并可缩短制种周期。若要提取羊肚菌菌丝中糖分，则应将高羊肚菌培养在麦麸蛋白胨液体培养基（麦麸5%，蛋白胨0.2%, 葡萄糖2%, MgSO0.1%, KHPO0.1%）上。
刘士旺等摸索了羊肚菌液体培养条件以及对培养基进行了筛选，结果表明PYG培养基（含0.1%酵母提取物的PDA）合适的液体培养条件是：25100rpm，装量100ml/500mL三角瓶，加10粒玻璃珠，pH7.5。正交实验筛选的摇瓶培养基组成为麦芽汁50%，玉米粉1.5%，酵母提取物0.5%，蔗糖1.5%。以此培养基为基础，筛选出4种生物量较高的液体培养基。赵良启[19]等则研究了圆锥羊肚菌液体发酵的条件。
对于固体发酵，韩建荣报道：羊肚菌、尖顶羊肚菌、黑麦羊肚菌和皱柄羊肚菌在玉米粉培养基或马铃薯粉培养基上进行固体发酵时，菌丝生物量之间无显著差异。4种羊肚菌中，尖顶羊肚菌的降解淀粉能力最强。在培养基中添加钙离子和氮源以及将发酵时间从15天延长到25天均能显著提高羊肚菌的菌丝生物量、α-淀粉酶活力和淀粉降解率。在添加10%黄豆粉、0.1%氯化钙，25℃发酵25天的玉米粉和马铃薯粉的发酵产物中，尖顶羊肚菌对玉米粉的降解率达到74.2%，对马铃薯淀粉的降解率达到79.8%。
3. 细胞水平的研究
Volk从细胞学角度揭示了羊肚菌的生活史：子实体的发育、子囊孢子的发育、营养菌丝的形成、异核体的形成、菌核的形成、菌核的萌发和原基的发育。他特别指出羊肚菌营养菌丝的每个细胞分区中 ，平均有10~15个细胞核，且常发生菌丝融合，作为静止结构的菌核，实际上是由初生菌丝或次生菌丝的重复分枝及菌丝末端的膨胀构成的假菌核。子囊的发育是通过自核交配而不是通过子实体子实层基内的菌丝融合而重新形成异核体。
陈易飞、林彬分别对羊肚菌、粗腿羊肚菌的子实体进行显微观察；李绮等应用电子显微镜对羊肚菌子实体的亚显微结构-膜边体、高尔基体、线粒体、隔膜与伏鲁宁体进行了观测研究。
张鉴铭等从培养在培养基中的尖顶羊肚菌菌丝体分离出原生质体，用纤维素酶2%+崩溃酶1%+半纤维素酶0.5%+蜗牛酶0.5%的酶液，发现在30℃下经4.5小时处理的产量最高，为6.2×10个原生质体/100mg/ ml。由此分离的原生质体再生能力很强，液体培养18小时即可再生成菌丝。刘士旺等的研究结果表明多种酶的混合使用较单一酶效果好，选用蜗牛酶4mg/ml+溶壁酶5mg/ml+纤维素酶4mg/ml作为酶解液原生质体产量最高，原生质体再生率较以前提高5.5倍；通过诱变羊肚菌原生质体，获得原生质体诱变再生株尖顶羊肚菌（ M. conica）CGAC-950637，其生物量和总氨基酸比出发菌株都有所提高。影响原生质体形成的因素有机械作用、菌丝培养方式、菌龄、酶解时间、温度、不同稳定剂及缓冲液，打散菌丝体的方法无法产生原生质体。
4. 生化与分子生物学的研究
Moriguchi M等从羊肚菌菌丝中分离纯化到3个γ-谷氨酰转肽酶,分子量分别为155，000 Da；219，000 Da；102，000 Da。这三种酶催化不同γ-谷氨酰复合物的水解和转肽反应，水解Km在10~10数量级之间；转肽Km为10~10数量级之间。该酶活性被L-丝氨酸和硼酸盐抑制。
龙正海等发现不同生长时期菌丝体的氨基酸含量变化较大，与此同时酯酶同功酶活性也呈现相应的变化规律，表明羊肚菌菌丝体生长过程中酯酶同功酶活性跟氨基酸代谢之间存在一定相关性。同功酶分析还发现不同子实体菌株及同一子实体不同单孢菌株间的酯酶同功酶谱基本相同，子实体与菌丝体均具有稳定的9条酶带。王新宇等发现黑脉羊肚菌、尖顶羊肚菌和羊肚菌在相同培养液及培养条件下，菌丝体产量、总蛋白及可溶性蛋白质的含量无显著差异；同一个种在含不同浓度麦芽糖、蛋白胨和维生素B培养基上生长时，总蛋白和可溶性蛋白质的含量无显著的差异，但菌丝体产量差异较大，酯酶同功酶的组成也有一定的差异。
Bisakowski B等将羊肚菌的粗提取物用硫酸铵沉降得到脂氧合酶，研究发现部分纯化的脂氧合酶提取物在pH3.0显示最大活性,在pH4.0-6.0显示62.5%的活性，在pH7.0-10.0时则小于12.5%；动力学研究结果为酶的最大反应速度Vmax=0.314摩尔/毫克·分和Km=1.59×10M；酶在亚油酸为底物时显示强的活性，而使用亚麻酸时只有29%的活性，单、双、三亚油酸时大约只有11%的活性；脂氧合酶对花生四烯酸显示了相对较强的亲和力（83%）。脂氧合酶在pH6.0的条件下催化亚油酸转化为9、10、12、13-氢过氧化物的速率比36:24:14:26。
在羊肚菌多酚氧化酶催化下，多酚复合物通过结合甲基硫醇形成氧-醌。羊肚菌在pH为7时，有较高的结合硫醇的性质，而其羟基苯的衍生物含量低，可见其它化合物也参与了反应，羊肚菌多酚氧化酶底物专一性相对与水果与蔬菜的或含有单酚和双酚氧化酶的蘑菇而言是低的。这研究表明羊肚菌在除臭（包括口臭）方面有广阔的应用前景。
Yu S等从尖顶羊肚菌、粗羊肚菌中纯化到α-1，4-葡聚糖裂合酶，该酶能催化具有α-1，4-葡糖苷键的葡萄糖寡聚物和多聚物（如麦芽糖），产生1，5-脱水-D-果糖。酶的分子量约为121，000Da，pH各为4.5和4.4，最适pH范围在5.5-7.5之间，pH6.5时表现最大酶活力，酶反应适温在37-48℃之间（具体要视基质而定）。酶的抑制剂有PCMB、葡萄糖、麦芽糖等及类似物；测定酶的约35%的氨基酸序列后发现所测序列中两个酶有91%是相同的；两个酶显示免疫交叉反应。
Bojsen K和Yu S等进一步研究了上述两种羊肚菌α-1，4-葡聚糖裂合酶的基因，发现各有3,201bp和3,213bp的编码区，在两个基因的同一位置发现了13个小的内含子；两个酶在氨基酸水平有86%的相同，它们各自编码1,066和1,070个氨基酸；酶基因启动子的分析揭示了一些假定的DNA调节元件，如Area和Crea位点，它们分别与氮和碳代谢相关。还有CCAAT/CAAT盒，则与基因表达有关。对从真菌Peziza中分离的裂合酶基因557个bp 进行测序，由所测核酸片段推出的氨基酸序列与粗羊肚菌裂合酶有76%的相同。他们还将粗羊肚菌裂合酶基因转入毕赤酵母和曲霉属细胞内并得到了表达。
Rohe M对位于尖顶羊肚菌的线粒体内的两个线性质粒之一pMC3-2 进行了测序，大小为1,044bp，有末端倒转重复序列分别长713bp 和710bp ，两个开放阅读框，跨度分别为2,706bp和918bp。ORF1可能编码一个病毒的B型DNA聚合酶；而ORF2，则尚未见有已发表的蛋白质或DNA序列同源。质粒pMC3-2结构和其他丝状真菌中分离到的线性质粒一样，与腺病毒的遗传元件有较近的关系。将分离到带有线性质粒pMC3-2的线粒体RNA，凝胶电泳，然后用线性质粒pMC3-2作为探针进行Northern杂交。得到的杂交片段只是pMC3-2的中心部分和特有的（线粒体 RNA） mtRNA的片段。杂交片段（2.8kb和1.0kb）的大小与从核苷酸序列推断出的pMC3-2的两个ORF的长度一致。因此，编码DNA聚合酶和一个未知蛋白的两个ORF是在带有质粒的羊肚菌线粒体中转录的。
核糖体核糖核酸（rRNA）是存在于生物细胞内的"活化石"，其基因rDNA分子进化信息量大，趋同性小，可比性强，已被广泛选作生物发育系统学的分子指标，也是系统发育物种概念界定物种的依据之一。为了从分子水平研究羊肚菌属真菌的分类和系统发育地位，羊肚菌（Morchella esculenta）的5.8S、17S、18S 、25 S 、28S rRNA基因序列；尖顶羊肚菌（Morchella conica）5.8S 、17S、 25S rRNA的基因序列已陆续被测定。用基因步行法对羊肚菌和尖顶羊肚菌编码rRNA基因的内部转录空间ITS从两个方向进行测序后表明，两个种的ITS有差异，羊肚菌为750bp,尖顶羊肚菌1150bp。对羊肚菌属、钟菌属、盘菌属和跟它们亲缘关系很近的鹿花菌属的28S rDNA通过PCR扩增，发现存在着限制性片段长度多性RFLP，可由此推断出它们的种系发生的关系。28S rRNA基因的5'端的多态性比3'端的多。根据RFLP，分离的三个尖顶羊肚菌与本研究中 的其它羊肚菌的差异分别为0.5、1.0和1.5%。而鹿花菌gigas与羊肚菌的差异约为6.2%。在某些情况下，种内比不同种间有更多的遗传多样性。结果支持了羊肚菌属只有几个（可能三个）多态种的假说。
5. 讨论与展望
我国羊肚菌资源丰富，目前在20多个省、市、自治区都有发现羊肚菌的报道，且羊肚菌分布新区不断发现，但由于羊肚菌较高的经济价值，乱采乱挖、破坏资源现象严重，所以应该合理保护、利用、开发这些资源。开发人工栽培是解决羊肚菌紧俏的出路，实现羊肚菌商业化大规模生产无疑是真菌学家急需攻克的难题。
羊肚菌菌丝是一种易获得的可利用资源，所以应加强菌丝的应用开发。改进发酵过程中的条件，促进发酵过程朝提高目的产物的方向进行，提高产物品质，降低发酵成本，是液体发酵研究的方向。作为珍稀食药用菌，目前对其有效成分（主要应该是羊肚菌多糖）的纯化和研究尚属不够。提取、开发、利用其有效成分特别是抑癌物质应有很好的前景。
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