DNA芯片技术研究进展
DNA芯片技术研究进展
高良才
DNA芯片或微阵列技术是近年出现的DNA分析技术。它是指利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针，或将液相合成的探针由微阵列器或机器人点样于尼龙膜或硅片上，再与经放射性同位素或荧光物质标记的DNA或cDNA杂交，通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描后，对杂交结果进行检测和分析，以此反映目的材料中有关基因的各种情况。其显著特点在于高度的并行性、多样性、微型化和自动化。
1 技术的发展
核酸杂交技术在20世纪60年代就被用于对染色体DNA同源性的分析。20世纪80年代初，由于核酸探针技术的进步使得核酸杂交技术的应用范围逐步扩大，如：点或狭缝印迹杂交、Southern和Northern杂交等。可是传统核酸杂交技术不能通过一次杂交了解多个探针序列信息，反向点杂交技术克服了这个缺点。
随着人类基因组计划和微生物基因组计划的实施与飞速进展，人们迫切需要通过一次杂交了解细胞整体变化的情况，比较不同条件下细胞间表达水平上的变化。然而，20世纪90年代以来相继发明的减法杂交、抑制减法杂交、栅格文库和差异显示技术由于操作方法复杂、技术要求高而使其应用受到一定的限制。20世纪90年代中期产生的DNA微点阵技术以其操作简便、结果易于分析、提供信息量大和配套仪器齐全而倍受人们的青睐。它是微电子学和分子生物学相结合的产物。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。
2 DNA芯片技术的基本过程
2．1 DNA方阵的构建
DNA点阵指在芯片表面通过合成和/或化学反应使寡核苷酸或肽核酸(PNA)固定在芯片上。美国Affymetrix公司采用光刻合成法在芯片上直接合成寡核苷酸点阵，其基本过程是用水银灯在芯片表面形成光刻罩，选择性地从寡核苷酸链上去除光敏保护基团。这种方法只能合成小于25nt的寡核苷酸。美国加州Icye Pharmaceuticals公司Protogen公司采用压电印刷方式像喷墨打印机似的将装有某种碱基的试剂滴到晶片表面以构成方阵。因该法不需要与载体表面直接接触，故有很高的效率，但制造工艺还不太成熟。
Narogen公司采用可控电场将事先合成并经生物素标记的寡核苷酸或PNA直接固定到各点上构成阵。它的优点在于芯片制造速度快、成本低，而且芯片之间制造误差小，因此，大规模利用这种技术生产DNA芯片已成为现实。另外，用高产量的逐步合成技术也可在芯片表面直接合成寡核苷酸。它是利用疏水表面与亲水孔间形成单一的点来合成寡核苷酸的，此法较灵活，适用于研究。Southern等(1998)还描述了一种用微电极阵列使合成中的寡核苷酸链脱保护来合成寡核苷酸的方法。还有报道将寡核苷酸点在20微米厚的凝胶上的，但寡核苷酸必须扩散到胶内，因此，只有短的寡核苷酸才可以使用。
2．2 探针的制备
制备探针的关键一步是及时从细胞或组织中分离mRNA，因为细胞表达谱在受到外来刺激后会很快发生改变。而为了提高阅读灵敏度，DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增。目前标记核苷酸最常用的方法是荧光标记。标记物常用的有Cy3、Cy5、FITC和TRITC(罗丹明)。当然，掺入生物素也是一种方法。
2．3 杂交
DNA芯片用于检测基因表达、多态性或突变等，这实际上是一种反向斑点杂交技术，不过影响这种杂交的因素很多。英国牛津大学Southem研究组(1998)发现，传阻因素的影响尤其重要：DNA分子中任何带正电或负电的残基都会影响杂交效率。另外，在有利于杂交双链形成的条件下，探针分子本身也易于形成二级结构甚至三级结构，为此，丹麦科学家Nielsen于1991年首先合成了肽核酸(PNA)。PNA与DNA不同的是：在核糖磷酸骨架中不存在带负电的磷酸基因，因而杂交时不需盐离子来抵消链间的静电排斥。这样既易于杂交，自身也不会形成二级或三级结构，而且形成的DNA-PNA杂交分子的稳定性和碱基配对的特异性也大大提高。因此，虽然PNA的制造比DNA要麻烦一些，但仍将成为芯片制造的首选材料。
2．4 杂交图谱的检测和处理
目前DNA探针大多采用荧光标记法，因此可用扫描同焦显微镜来检测杂交点的荧光信号，它重复性好但灵敏度相对较低。所以，人们正在研究多种替代方法，如：质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等。其中质谱法提供的信息多、快而精确，并且还可对突变基因进行准确定位，因而最有发展前途。不过由于在探针的化学合成上还存在一些问题，质谱法还不如荧光标记法用得普遍。而这些图谱的多态性与存储都由专门设计的软件来完成。
3 DNA芯片技术的应用
3．1 测序
Sanger、Maxan、Gilbert等标准的DNA测序方法对HGP这类大范围的测序工作已显过时，因此用DNA芯片快速测定DNA序列具有十分诱人的前景。Hacia等(1998)用含有4.8万个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异，结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2％至83.5％之间，高度提示了两者在进化上的相似性。
3．2 基因表达水平的检测
将不同条件下从某生物体中转录出来的所有mRNA标记成探针后，再与代表它所有基因而制成的寡核苷酸/PNA方阵杂交，通过分析杂交信号，就可知道不同情况下每个基因是否已表达及表达多少。据估计，一个由10万个不同cDNA构成的微方阵可通过一次杂交对整个人类基因组的表达情况进行检测。DeRisi和Wodicka等(1997)曾用包含所有酿酒酵母基因在内的DNA微阵列，观察了整个酵母基因组在发酵到呼吸反应过程中各基因表达的动态变化。
3．3 基因诊断与基因药物的开发
从正常人的基因组中分离出DNA并与DNA芯片上的方阵杂交，就可得到标准图谱。从病人基因组中分离DNA并与方阵杂交就得到病变图谱。比较、分析这两种图谱，就能得出病变的DNA信息并进行治疗。目前DNA芯片在疾病诊断方面已有产品面市。美国Affymetrix公司生产的检测逆转录酶基因的HIV芯片，可以判断被检者是否携带艾滋病毒；还有检测p53基因是否突变来判断癌症的芯片，以及诊断有无药物代谢缺乏症的细胞色素p450芯片等。近来，美国两名科学家宣布，他们研制的仿生芯片可供医学研究和诊疗用，并认为将给医学带来新突破。这是人体活细胞首次由电脑控制的创举，通过指挥微芯片来开关细胞，有朝一日将可命令癌细胞开放门户让有害物质进入，最终导致癌细胞自我灭亡。
3．4 基因的多态性检测
Lee等(1996)用含有13.5万个探针的DNA微阵列分析了人线粒体基因组DNA多态性变化。该组探针互补于人线粒体基因组全长16.6kb，将之与不同个体来源的基因组DNA杂交，发现人线粒体基因组存在16 493位 T→C突变、16 223位C→T等多位点突变的DNA多态性特征。当然，DNA微阵列还可用于细胞的表型分析、基因突变分析、基因功能分析等等。总之，DNA微阵列就像一个高度浓缩的无比巨大的实验室，通过它可以进行不计其数的分子生物学操作。
4 DNA芯片技术的现状和展望
DNA微阵列或芯片几乎可用于核酸杂交技术的各个方面，而在同时比较各组织或同一组织在不同状态下成千上万个基因的表达状况、DNA序列分析等方面具有更大的优越性。有人誉赞“微阵列技术铺平了通往21世纪的医学之路”。美国在该技术的方法与应用上召开过两次会议，克林顿总统还在国会演讲时赞赏该技术。新世纪伊始，国务院组织的“百名院士，百场讲座”的第一讲就由北京大学的陈京教授主讲DNA芯片技术。朱镕基、李岚清等国家领导人对此也给予高度的评价。鉴于此技术具有巨大的理论意义和应用价值，目前全美已有25家公司投身于该技术的研制与开发，国内几家科研单位也开始了这方面的研究。随着现代制造技术的进步，DNA芯片在容纳更多信息的同时已日趋小型化，尤其在医学方面，其应用前景更是诱人。